先來認識什麼是 CRISPR:
目前應用CRISPR技術來檢測SARS-CoV-2的主要方法有以下幾種
一、DETECTR 檢測:
CRISPR–Cas12-based detection of SARS-CoV-2 (Google翻譯)- Nature期刊發布於2020年4月16日
全球最神!陽性預測95% 陰性為100% – Genet發布於2020年5月25日
病毒RNA從樣品中提取,使用 RT-LAMP 來擴增核酸,檢測時間約40分鐘,在測試的83個已知陽性樣本中,陽性預測率為95%,陰性預測率為100%,這是迄今為止最快的測試。機制是藉由 Cas12a–sgRNA 靶向蛋白複合體與目標序列綁定。類似的方法可直接 使用唾液檢測SARS-CoV-2病毒 而無需進行RNA提取,不過只能在足夠高的病毒量才能起作用
二、SHERLOCK 檢測:
追捕新型冠狀病毒的福爾摩斯… – 科學月刊發布於2020年3月11日
病毒RNA從樣品中提取,使用 RPA 來擴增核酸,檢測時間約1小時。RPA反應還含有產生 互補DNA 的逆轉錄酶,藉由 Cas13a 與互補的 crRNA 結合到病毒RNA的特定序列上,隨即啟動剪切反應。Cas13a除了會切下對應的mRNA之外,還具有非特異性剪切的附帶效力(collateral effect)。利用這個特性,張峰研究團隊設計了帶有螢光團的斷裂報告RNA(cleavage reporter RNA),當reporter被切之後就會發出螢光,偵測螢光即可用來判斷病毒核酸的存在。結合 Cas13a 的附帶效力與核酸等溫擴增技術,研究團隊建立了基於CRISPR的診斷法,研究團隊稱之為SHERLOCK(Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing),靈敏度可以達到10-18M。
三、AIOD 檢測:
All-in-One Dual CRISPR-Cas12a (AIOD-CRISPR) Assay: A Case for Rapid, Ultrasensitive and Visual Detection of Novel Coronavirus SARS-CoV-2 and HIV virus – biorxiv.org發布於2020年3月21日
與SHERLOCK診斷測試非常相似,只是測試的步驟順序和使用的Cas蛋白有所不同。這個方法是將反應所需的所有試劑混合在單罐、單一溫度下運作。AIOD 設計了兩個 Cas12a-crRNA 複合物,使用兩個 crRNA 可提高檢測的靈敏度,在 藍光LED 下即可觀察到產生的螢光。
四、CREST 檢測:
A Scalable, Easy-to-Deploy, Protocol for Cas13-Based Detection of SARS-CoV-2 Genetic Material – biorxiv.org發布於2020年4月21日
使用支援藍牙的微型 PCR 機器與使用9V電池的 紙盒版本 螢光觀察器 P51,病毒RNA從樣品中提取後進行反轉錄,然後使用 Taq聚合酶 進行擴增。Cas13蛋白透過嚮導RNA,在發現病毒RNA的特定序列後,執行非特異性的附帶效力剪切,接著透過 P51來檢測是否出現螢光
結論:
將CRISPR/Cas system從分子生物學基因剪輯的研究上,推展到了臨床分子診斷的應用,不論是在病原體的檢測、基因型鑑定或癌症突變基因的偵測,都提供了一個新的高敏感度與高專一性的新方法,對於需要快速、價格低廉、高敏感度的核酸檢測大有助益。